Cromatografía en columna: fundamentos y procedimiento

Cromatografía en Columna

La cromatografía en columna es una técnica de separación de los diferentes componentes de una mezcla. Esta separación se basa en la distribución de los compuestos entre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil. La interacción entre las fases y los componentes de la mezcla dependerá de la polaridad de cada compuesto.

La cromatografía en columna se puede dividir en dos partes principales: la fase estacionaria, que consiste en un sólido activo finamente dividido (llamado adsorbente), y la fase móvil, que es un líquido denominado eluente.

Fundamento de la Separación

La separación en la cromatografía en columna se basa en el adsorbimiento selectivo de los componentes de la mezcla sobre los centros activos del adsorbente. Este adsorbimiento depende de la polaridad de cada compuesto y de su solubilidad en el eluente.

Como fase estacionaria, los sólidos más utilizados como adsorbentes son el gel de sílice y la alúmina neutra (que en su preparación se somete a procesos de neutralización con un ácido y agua destilada).

Interacciones entre la Fase Estacionaria y el Compuesto

• Compuestos no polares: se unen a la fase estacionaria mediante fuerzas de Van der Waals (fuerzas débiles de interacción).
• Compuestos polares: interactúan mediante interacciones dipolo-dipolo, interacciones directas (coordinación, enlace de hidrógeno, formación de sales).

En general, cuanto más polar sea el grupo funcional de un compuesto, más fuerte será su interacción con la fase estacionaria. En cuanto al solvente, los solventes polares disuelven compuestos polares, mientras que los compuestos no polares se disuelven en solventes no polares (lo similar disuelve lo similar).

Preparación de la Columna Cromatográfica

Después de un lavado previo para eliminar cualquier residuo en las paredes del tubo, la columna (un tubo de vidrio cerrado en un extremo por una llave de teflón) debe fijarse en posición vertical. Se llena parcialmente con el solvente que se utilizará en la cromatografía y se introduce un trozo de algodón en el fondo, empujándolo con una varilla de vidrio y presionándolo hasta que salga todo el aire en forma de burbujas.

Carga del Adsorbente

Existen dos métodos para cargar el adsorbente (fase estacionaria) en la columna:

• Método a húmedo: el adsorbente se introduce en la columna en suspensión, es decir, en una mezcla de solvente y sólido no disuelto. Esta mezcla se prepara en un vaso de precipitados, añadiendo el adsorbente poco a poco al solvente y agitando con una varilla de vidrio para eliminar las burbujas de aire. Después, se vierte lentamente en la columna, abriendo la llave para que el solvente fluya, y se golpea suavemente para obtener un relleno uniforme y sin burbujas de aire.
• Método a seco: se llena la columna con solvente y se deja percolar. Luego, se añade el adsorbente seco poco a poco hasta la altura deseada. Este método no es recomendable porque puede generar burbujas de aire que afecten a la calidad de la separación cromatográfica.

Introducción del Compuesto

Se lleva el nivel del solvente por encima del adsorbente, se abre la llave y se añade el compuesto (líquido puro o diluido, o sólido previamente disuelto) de forma uniforme sobre la superficie del adsorbente con una pipeta. Una vez añadido el compuesto, se deja que la capa líquida sea adsorbida por la columna, bajando el nivel del solvente. Se añade cuidadosamente una pequeña cantidad de solvente para evitar que el adsorbente se seque.

Elución

Se suele empezar con un solvente poco polar (como el ciclohexano) y luego se aumenta la polaridad gradualmente para que la transición entre solventes no sea brusca. Si la diferencia de polaridad entre dos solventes es muy grande, se puede generar un calentamiento en el adsorbente que podría provocar una fisura en la columna.

En algunos casos, las bandas cromatográficas se pueden observar a simple vista. Si no es así, se deben recoger fracciones de volumen constante en recipientes adecuados y analizar su contenido mediante cromatografía en capa fina (TLC).