Metodi di Dosaggio Immunologico: ELISA, EIA ed EMIT per la Diagnostica di Laboratorio

Esempi di Applicazione dei Dosaggi ELISA Non Competitivi

Un esempio di dosaggio ELISA non competitivo è quello “a sandwich”, che si esegue in eccesso di anticorpi. Si aggiunge il campione e lo si lascia in incubazione; successivamente, si aggiunge il tracciante e si procede al lavaggio; infine, si aggiunge il substrato e si misura il segnale.

Al fine di validare il test, le operazioni sopra riportate vengono effettuate in due pozzetti distinti, che differiscono per il tipo di anticorpo primario introdotto inizialmente: un pozzetto viene riempito con l'anticorpo specifico per l'antigene che si vuole individuare, mentre l'altro viene saturato con un anticorpo non specifico.

Affinché il test possa ritenersi valido, in primo luogo deve risultare negativo in quest'ultimo pozzetto; nel caso in cui il campione biologico saggiato contenga realmente l'antigene d'interesse, il test deve essere positivo nell'altro pozzetto, quello saturato con l'anticorpo primario specifico. Il test ELISA non competitivo è un test qualitativo e semi-quantitativo: non fornisce un valore effettivo, ma afferma la presenza o l'assenza dell'analita.

Dosaggio Immunologico EIA Non Competitivo: Metodi e Applicazioni Diagnostiche

Si tratta di metodi immunoenzimatici; l’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori.

Un esempio di questo metodo è il test immunocromatografico a flusso laterale, che si basa sulla reazione Ag-Ab su supporto solido. Il test utilizza strisce di polimeri particolari, dotati della capacità di trasporto capillare di fluidi, situati su un dispositivo in plastica. Vi sono tre zone principali:

• a) Zona Campione: viene deposto il materiale biologico in cui si vuole verificare la presenza di un determinato Ag. Il campione migrerà per capillarità verso la
• b) Zona Coniugato: dove è presente l’Ab specifico contro l’Ag in esame, coniugato con oro colloidale. In caso di presenza di Ag, si formerà un immunocomplesso. La migrazione continuerà infine verso la
• c) Zona di Lettura: dove sono fissati in due punti diversi gli Ab specifici verso la sostanza in esame (zona test) e gli Ab anti-immunoglobuline (zona controllo).

Nella zona di lettura, la reazione Ag-Ab produrrà la formazione di una banda colorata in rosso grazie alla presenza di oro colloidale.

In caso di negatività (assenza della sostanza in esame), si formerà una sola banda colorata nella zona controllo, in quanto si avrà una sola reazione fra anticorpi coniugati e anti-anticorpi adesi al supporto: questo indica che la reazione immunocromatografica è avvenuta correttamente.

In caso di positività (presenza della sostanza nel campione), avremo invece due bande colorate in rosso, poiché la reazione avverrà non solo a livello degli anti-anticorpi (controllo) ma anche con gli anticorpi anti-sostanza in esame (zona test).

Un altro esempio è il test POCT (Point-of-Care Testing): un'analisi medica svolta in prossimità del sito di cura e assistenza del paziente. Si applica a test delle urine, della glicemia o, ancora, come test di gravidanza.

Dosaggio Immunologico EMIT: Metodo e Applicazioni Diagnostiche

I metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo, mostravano una variazione (aumento/riduzione) della propria attività catalitica.

I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD-dipendente (G6PD) è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggiore capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito all’interazione con l’anticorpo.

Viene utilizzato per il dosaggio di farmaci cardioattivi, antineoplastici, antiepilettici o per la verifica di abuso di sostanze.