Mioglobina ed Emoglobina: Struttura, Funzione e Regolazione del Trasporto di Ossigeno

Mioglobina ed Emoglobina

1. Mioglobina: Struttura e Funzione

Esempi noti di proteine globulari sono la mioglobina e l'emoglobina. Forse la proteina globulare più studiata è l'emoglobina, meglio conosciuta, facilmente separabile e purificabile dagli eritrociti. È stata la prima proteina cristallizzata, caratterizzata mediante ultracentrifugazione, e la prima per cui è stata identificata la causa molecolare di una malattia proteica. Allo stesso modo, è stata la prima per cui sono state sviluppate teorie sulla cooperatività. È stata poi individuata un'altra proteina di struttura più semplice, con funzioni analoghe, che servirà ad introdurre lo studio dell'emoglobina. Si tratta della mioglobina.

Questa proteina differisce dall'emoglobina, cattura l'ossigeno ed è presente nei muscoli e in altri tessuti. La mioglobina è una proteina composta da una singola catena polipeptidica, che possiede 8 eliche alfa, nominate dalla A alla H (a partire dal terminale N). La maggior parte della struttura è costituita da eliche alfa, modificate in alcune sezioni: la fine carbossilica di 4 delle 8 eliche forma un'elica 3₁₀ (3 residui per giro); il passo di questa elica è più stretto e più lungo. Può presentare maggiori interferenze steriche, motivo per cui è meno abbondante dell'elica alfa ed esiste solo in brevi regioni. Si trova solitamente alla fine di un'elica, attorno a un giro distorto. I segmenti non elicoidali della mioglobina sono denominati con le due lettere dei segmenti elicoidali che collegano (es. AB, ecc.).

Associata alla proteina vi è una parte non proteica, il gruppo eme, che si trova in una cavità idrofobica con cui interagisce tramite legami di van der Waals. Il gruppo eme contiene un atomo di ferro (Fe) al centro di un anello tetrapirrolico, a cui si lega tramite quattro legami di coordinazione con gli atomi di azoto (N). La quinta posizione di coordinazione del Fe è occupata da un residuo di istidina (His F8, nota come istidina prossimale), mentre la sesta posizione di coordinazione è occupata da una molecola di ossigeno. La conservazione dell'ossigeno è la funzione primaria della mioglobina, mentre il suo trasporto attraverso il sangue è una funzione dell'emoglobina. (Un legame di coordinazione è un legame covalente in cui entrambi gli elettroni condivisi provengono dallo stesso atomo o ione).

Di fronte e sul lato opposto all'istidina prossimale (rispetto al piano del gruppo eme) si trova un altro residuo di istidina, la His E7 o istidina distale. La sua funzione è impedire l'allineamento lineare della molecola di ossigeno (O₂) con l'atomo di Fe, che porterebbe all'ossidazione del Fe²⁺ a Fe³⁺. Introduce, cioè, un impedimento sterico che favorisce l'ossigenazione del ferro invece della sua ossidazione. Rende anche meno forte il legame con CO (monossido di carbonio), per il quale il gruppo eme isolato ha un'affinità molto maggiore rispetto all'ossigeno. Inoltre, l'istidina distale agisce come una "trappola" per i protoni (ricordiamo il pKa di circa 6 dell'anello imidazolico) e impedisce l'azione catalitica dei protoni sull'autossidazione del Fe²⁺. Infatti, il Fe²⁺ agirebbe da riducente sull'H⁺, passando a Fe³⁺ e provocando la riduzione di O₂ a O₂^- (ione superossido). (La transizione Fe²⁺ + O₂ → Fe³⁺ + O₂^- è simultanea, con formazione di superossido). Così, la His E7 protegge dai protoni che potrebbero entrare nella cavità dell'eme nella deossimioglobina.

Il legame di una molecola di ossigeno al gruppo eme provoca un piccolo cambiamento conformazionale dovuto alla diminuzione del raggio ionico dell'atomo di Fe²⁺. Nella deossimioglobina, il Fe²⁺ (configurazione elettronica d⁶) è ad alto spin (S=2, paramagnetico), quindi il suo raggio ionico è relativamente grande. Passando all'ossimioglobina, il Fe²⁺ diventa a basso spin (S=0, diamagnetico), diminuendo così il suo raggio ionico. Questo permette all'atomo di Fe di posizionarsi nel piano della porfirina, tirando l'istidina prossimale e, di conseguenza, il resto della catena polipeptidica. Questo movimento tira l'elica F (che contiene l'istidina prossimale), trasmettendo un cambiamento conformazionale che facilita l'accesso dell'O₂.

La curva di saturazione della mioglobina per l'ossigeno è iperbolica (rappresenta la frazione di molecole sature, MbO₂/Mb_totale, in funzione della pressione parziale di O₂, pO₂).

2. Emoglobina: Struttura, Cooperatività e Regolazione

Struttura e Cooperatività dell'Emoglobina

A differenza della mioglobina, l'emoglobina è un tetramero costituito da due diversi tipi di subunità (α e β), con una composizione α₂β₂, correlate simmetricamente. Le strutture terziarie delle subunità α e β sono molto simili a quella della mioglobina, nonostante ci sia solo un'identità del 18% nei residui amminoacidici (indicativo di divergenza evolutiva con modifiche conservative).

Le subunità sono associate in modo da interagire attivamente: 35 amminoacidi partecipano all'interfaccia α₁β₁ (e alla sua equivalente α₂β₂), mentre all'interfaccia α₁β₂ (e α₂β₁) partecipano solo 19 amminoacidi. Alcune interazioni sono di tipo idrofobico, ma sono presenti anche legami idrogeno e coppie ioniche (ponti salini) di grande importanza.

L'ossigenazione provoca cambiamenti significativi nella struttura quaternaria, che interessano principalmente le interazioni α₁β₂ e α₂β₁, ma non le interazioni α₁β₁ o α₂β₂. Come risultato, una coppia αβ ruota di circa 15° rispetto all'altra coppia αβ, passando da uno stato chiamato T (teso), caratterizzato da bassa affinità per l'ossigeno, a uno stato R (rilassato), ad alta affinità per l'ossigeno. Il legame della prima molecola di ossigeno induce un effetto di cooperatività positiva sulle altre tre subunità, facilitando il loro legame con l'ossigeno. È lo spostamento dell'atomo di ferro verso il piano dell'eme che innesca questi cambiamenti conformazionali e la transizione delle subunità dallo stato T allo stato R.

Lo stato T è stabilizzato da numerosi ponti salini (legami ionici) tra le subunità. Il passaggio da T a R comporta la rottura di questi ponti salini, un processo guidato dall'energia liberata dalla formazione del legame di coordinazione Fe-ossigeno. La presenza dei due stati, R e T, giustifica la cinetica sigmoidale della curva di saturazione dell'emoglobina con l'ossigeno in funzione della pO₂: inizialmente l'affinità è bassa (predomina lo stato T) e alla fine l'affinità diventa alta (predomina lo stato R). Il passaggio dallo stato T allo stato R coinvolge uno spostamento dell'istidina F8 (la prossimale) e dell'intera elica F.

Effetto Bohr e Trasporto di CO₂

L'emoglobina presenta l'effetto Bohr: lega H⁺ e rilascia ossigeno (o viceversa, rilascia H⁺ legando ossigeno). Il cambiamento conformazionale indotto dal legame dell'ossigeno rende alcuni gruppi sull'emoglobina leggermente più acidi. L'effetto Bohr facilita il rilascio di ossigeno ai tessuti metabolicamente attivi. Nei capillari tissutali, il CO₂ prodotto dai tessuti entra negli eritrociti e viene convertito in bicarbonato (HCO₃^-) e protoni (H⁺) dall'enzima anidrasi carbonica (CO₂ + H₂O ⇌ H⁺ + HCO₃^-). I protoni liberati vengono legati dall'emoglobina, riducendone l'affinità per l'ossigeno e promuovendone il rilascio proprio dove serve di più (nei tessuti che consumano più ossigeno e producono più CO₂).

La diminuzione del pH (aumento di [H⁺]) riduce l'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno perché favorisce la formazione di ponti salini che stabilizzano lo stato T. Ciò avviene tramite la protonazione di specifici residui, come l'istidina HC3 (C-terminale) delle catene β e i gruppi amminici N-terminali delle catene α. L'istidina protonata, carica positivamente, può formare un ponte salino con un gruppo carbossilato carico negativamente.

Oltre a trasportare ossigeno dai polmoni ai tessuti, l'emoglobina trasporta anche una parte del CO₂ nella direzione opposta, dai tessuti ai polmoni. Questo trasporto avviene tramite la formazione di carbammati con i gruppi amminici N-terminali delle catene globiniche (R-NH₂ + CO₂ ⇌ R-NH-COO^- + H⁺). Questo processo è favorito nella forma deossigenata (stato T) dell'emoglobina. Per reciprocità, un'alta concentrazione di CO₂ favorisce il rilascio di ossigeno (diminuisce l'affinità). Il CO₂ trasportato dall'emoglobina come carbammato costituisce circa il 13-15% del CO₂ totale trasportato ai polmoni (la maggior parte, circa il 75-80%, è trasportata come bicarbonato nel plasma, e una piccola frazione, 5-10%, è disciolta fisicamente nel sangue). Sebbene la percentuale di CO₂ trasportata dall'emoglobina non sia la maggioritaria sul totale presente nel sangue, bisogna considerare che solo una frazione del CO₂ totale viene scambiata ad ogni ciclo respiratorio. In questo contesto, il trasporto via emoglobina diventa più rilevante, contribuendo significativamente allo scambio netto di CO₂.

Modelli Allosterici

Esistono due modelli principali per spiegare il comportamento allosterico e la curva sigmoidale dell'emoglobina: il modello concertato (o di simmetria, MWC, da Monod-Wyman-Changeaux) e il modello sequenziale (o indotto, KNF, da Koshland-Némethy-Filmer).

Nel modello concertato, la proteina può esistere solo in due stati conformazionali globali: uno stato T (teso) a bassa affinità per il ligando e uno stato R (rilassato) ad alta affinità. I due stati sono in equilibrio, e tutte le subunità si trovano nello stesso stato (T o R) in un dato momento. Il legame del ligando sposta l'equilibrio verso lo stato R. Questo modello prevede solo queste due conformazioni per l'intera proteina e non spiega facilmente i casi di cooperatività negativa osservati in alcune proteine.

Il modello sequenziale, invece, supera queste restrizioni. Propone che il legame del ligando a una subunità induca un cambiamento conformazionale solo in quella subunità. Questo cambiamento influenza l'affinità delle subunità vicine per il ligando, propagandosi sequenzialmente. Le variazioni conformazionali possono facilitare (cooperatività positiva) o ostacolare (cooperatività negativa) il legame alle subunità adiacenti.

Regolazione Allosterica (2,3-BPG)

L'emoglobina è una proteina allosterica: il suo legame con l'ossigeno è modulato da altre molecole (effettori allosterici) che si legano a siti diversi dal sito di legame dell'ossigeno. Le curve di legame all'ossigeno sono infatti diverse se misurate su emoglobina purificata o nel sangue intero, a causa della presenza di questi effettori.

Nel sangue, l'emoglobina ha un'affinità per l'ossigeno inferiore rispetto alla forma purificata. La molecola responsabile di questa riduzione di affinità è il 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG), presente negli eritrociti a una concentrazione di circa 4-5 mM (simile a quella dell'emoglobina). Questa molecola porta 5 cariche negative a pH fisiologico e si lega a una cavità centrale del tetramero di emoglobina, interagendo con residui basici (Lys, His) e i gruppi N-terminali delle catene β. Questo legame stabilizza la conformazione T (a bassa affinità). I cambiamenti conformazionali indotti dal legame dell'ossigeno (passaggio a R) modificano la cavità centrale, riducendo l'affinità per il 2,3-BPG, che quindi si dissocia. Il legame di queste molecole effettrici (come H⁺, CO₂, 2,3-BPG) a siti diversi da quello del ligando principale (O₂) è la caratteristica distintiva delle proteine allosteriche.

Adattamento e Varianti (HbF, Alta Quota)

L'emoglobina fetale (HbF) è diversa dall'emoglobina adulta (HbA). Ha una composizione α₂γ₂ invece di α₂β₂. Le catene γ hanno alcune differenze amminoacidiche rispetto alle β, in particolare nel sito di legame per il 2,3-BPG (una His carica positivamente nella catena β è sostituita da una Ser neutra nella catena γ). Di conseguenza, l'HbF lega il 2,3-BPG più debolmente. Pertanto, l'emoglobina fetale ha un'affinità per l'ossigeno maggiore rispetto all'emoglobina materna (HbA), facilitando il trasferimento di ossigeno dalla madre al feto attraverso la placenta.

Il 2,3-BPG gioca un ruolo anche nell'adattamento all'alta quota. In condizioni di ipossia cronica (come in alta quota), l'organismo aumenta la concentrazione di 2,3-BPG negli eritrociti. Sebbene la pO₂ alveolare diminuisca con l'altitudine, portando a una minore saturazione dell'emoglobina nei polmoni, l'aumento di 2,3-BPG abbassa l'affinità dell'emoglobina per l'O₂. Questo fa sì che, a parità di pO₂ nei tessuti, venga rilasciata una maggiore quantità di ossigeno, compensando parzialmente la ridotta saturazione polmonare. Questo adattamento si ottiene aumentando la concentrazione del modulatore allosterico negativo (2,3-BPG). Inoltre, nel corso di giorni e settimane, si verifica anche un aumento del numero di eritrociti e della quantità di emoglobina per eritrocita (policitemia). Una situazione simile, con aumento del 2,3-BPG, si può verificare in altre condizioni di ipossia, come l'insufficienza polmonare cronica e alcune forme di anemia (dove il problema è la ridotta capacità di trasporto dell'ossigeno, non la sua disponibilità).

Equazione di Hill

La saturazione frazionata (Y) dell'emoglobina con ossigeno, come già detto, mostra un andamento sigmoidale in funzione della pressione parziale di ossigeno (pO₂). In un modello estremamente semplificato (e non realistico) che assumesse un legame simultaneo e infinitamente cooperativo delle quattro molecole di ossigeno, l'equazione della curva di saturazione avrebbe la forma Y = (pO₂)ⁿ / ((P₅₀)ⁿ + (pO₂)ⁿ) con n=4. Per la mioglobina (n=1, nessuna cooperatività), l'equazione è Y = pO₂ / (P₅₀ + pO₂), dove P₅₀ è la pressione parziale di ossigeno alla quale si ha metà saturazione. Tuttavia, i dati sperimentali per l'emoglobina non si adattano a un'equazione con n=4.

Archibald Hill propose un'equazione empirica, nota come equazione di Hill, per descrivere la curva di legame: Y / (1-Y) = (pO₂ / P₅₀)^n_H, dove n_H è il coefficiente di Hill, un indice del grado di cooperatività. Un valore di n_H = 1 indica assenza di cooperatività (come nella mioglobina), mentre un valore di n_H uguale al numero di siti di legame (4 per l'emoglobina) indicherebbe una cooperatività infinita (modello "tutto o niente"). Per l'emoglobina umana, il valore sperimentale di n_H è circa 2.8-3.0, indicando una forte cooperatività positiva, ma non infinita.

L'equazione di Hill viene spesso linearizzata prendendo il logaritmo: log[Y / (1-Y)] = n_H log(pO₂) - n_H log(P₅₀). Un grafico di log[Y / (1-Y)] versus log(pO₂) (chiamato grafico di Hill) produce una retta nella regione centrale della curva di legame, la cui pendenza è uguale a n_H. L'intercetta sull'asse delle ascisse (quando log[Y / (1-Y)] = 0) corrisponde a log(P₅₀). Se non ci fosse cooperatività (n_H=1), il grafico di Hill sarebbe una linea retta con pendenza 1 per l'intero intervallo di pO₂. Per l'emoglobina, il grafico di Hill è lineare solo per valori intermedi di saturazione, con pendenza n_H ≈ 2.8, mentre tende a pendenza 1 a pO₂ molto basse (legame della prima molecola) e molto alte (legame dell'ultima molecola).

Emoglobinopatie (Anemia Falciforme, Talassemie)

L'importanza di specifici residui amminoacidici e la natura adattativa di alcune mutazioni sono evidenti nel caso dell'anemia falciforme, una malattia genetica caratterizzata dalla presenza di globuli rossi a forma di falce (da cui il nome). Gli individui affetti presentano una mutazione nel gene della catena β dell'emoglobina, che causa la sostituzione di un residuo di glutammato (Glu) in posizione 6 con una valina (Val). Questa mutazione dà origine all'emoglobina S (HbS) (S sta per sickle, falce in inglese). La valina idrofobica in posizione 6 sulla superficie della deossiemoglobina S crea una "macchia appiccicosa" che interagisce con una regione complementare su un'altra molecola di deossi-HbS. Questo porta all'aggregazione delle molecole di HbS in lunghi polimeri fibrosi all'interno degli eritrociti, specialmente a basse tensioni di ossigeno. Questi polimeri deformano i globuli rossi, conferendo loro la caratteristica forma a falce. Questi eritrociti deformati sono più fragili e meno efficienti nel trasporto dell'ossigeno, causando anemia.

È stato osservato che gli individui eterozigoti per la mutazione HbS (portatori sani del tratto falcemico) sono particolarmente comuni nelle regioni dell'Africa equatoriale dove la malaria è endemica. Questi individui mostrano una significativa resistenza alla malaria. La spiegazione risiede nel fatto che il parassita della malaria, Plasmodium falciparum, trascorre una parte cruciale del suo ciclo vitale all'interno dei globuli rossi dell'ospite, consumandone l'ossigeno. Nei soggetti eterozigoti, i globuli rossi contenenti HbS tendono a falcizzare più facilmente quando infettati dal parassita (a causa del suo consumo di ossigeno). Questi eritrociti falcizzati vengono rimossi più rapidamente dalla circolazione, interrompendo il ciclo vitale del parassita. Questo conferisce un vantaggio selettivo agli eterozigoti nelle aree malariche (l'omozigosi per HbS causa invece la grave forma di anemia falciforme).

Esistono molte altre mutazioni nei geni dell'emoglobina che causano malattie ereditarie, note collettivamente come emoglobinopatie. Un gruppo importante sono le talassemie, caratterizzate da una ridotta o assente sintesi di una delle catene globiniche (α o β). Circa il 5% della popolazione mondiale è portatore di una mutazione legata all'emoglobina. In molti casi, queste mutazioni portano ad anemia emolitica, poiché i globuli rossi diventano instabili a causa della presenza di emoglobina anomala o per la formazione di aggregati proteici.