Tecniche Avanzate di Diagnostica Molecolare: PCR, Sonde Geniche e DNA Ricombinante

Sonde Geniche: Definizione e Utilizzo in Diagnostica

Che cosa si intende per sonda genica? Che utilizzo può avere in diagnostica?

Le sonde geniche sono strumenti essenziali utilizzati per diagnosticare malattie genetiche. Sono costituite da un breve segmento di DNA a singolo filamento, marcato e complementare alla regione di interesse, cioè al bersaglio. Una sonda ideale riconosce solo il gene contenente una mutazione che provoca una malattia genetica (o il gene patogeno).

Questa tecnica è molto utilizzata per la diagnosi di tumori e si basa sull'identificazione di oncogeni. Ad esempio, *Ras* è l'oncogene più comune nei tumori umani. Mutazioni che attivano in modo permanente *Ras* si riscontrano nel 20-25% di tutti i tumori umani e fino al 90% in alcuni tipi di tumore, come quelli pancreatici.

Tecniche di Ibridazione Molecolare e Applicazioni Diagnostiche

Tecniche di ibridazione molecolare e loro utilizzo in diagnostica.

L'ibridazione, in biologia molecolare, è l'appaiamento complementare di due filamenti di DNA oppure di un filamento di DNA e l'altro di RNA. Si possono formare, quindi, delle doppie eliche di DNA-DNA, DNA-RNA o RNA-RNA.

L'ibridazione è una forma di riconoscimento molecolare estremamente specifica, basata sulla specificità di appaiamento tra le basi. Dunque, sequenze specifiche vengono identificate mediante la tecnica di ibridazione, la quale è utilizzata per diagnosticare malattie genetiche per mezzo di una sonda genica.

Le sonde geniche, come già descritto, sono costituite da un breve segmento di DNA a singolo filamento complementare alla regione di interesse, cioè al bersaglio. Una sonda ideale riconosce solo il gene contenente una mutazione che provoca una malattia genetica (o il gene patogeno). Questa tecnica è molto utilizzata per la diagnosi di tumori e si basa sull'identificazione di oncogeni.

Denaturazione degli Acidi Nucleici

L'ibridazione degli acidi nucleici richiede prima la loro denaturazione, ovvero condizioni che possono destabilizzare la doppia elica provocando la separazione delle due catene. Tali condizioni includono:

• Alte temperature;
• pH estremamente alcalino;
• Presenza di sostanze che rompono i legami a idrogeno.

La Reazione a Catena della Polimerasi (PCR)

Descrivi la tecnica della PCR e l'utilizzo che trova in diagnostica. Che cosa si intende per “Real Time PCR”?

La PCR (*Polymerase Chain Reaction*) è una reazione polimerasica a catena che amplifica un segmento di DNA mediante replicazione “in vitro”. Il procedimento avviene in un termociclatore, uno strumento che deve mantenere accuratamente le tre diverse temperature di incubazione della PCR, cambiare da una temperatura all'altra in un tempo definito e ripetere i tre cicli in maniera riproducibile (generalmente 30-40 volte).

Stadi del Ciclo di PCR

Ogni ciclo di PCR consta di tre stadi fondamentali:

1. Denaturazione: Si esegue a 95°C. Il DNA stampo a doppio filamento viene denaturato, cioè srotolato e aperto.

2. Appaiamento (*Annealing*): Si esegue a 50-60°C. I *primers* si appaiano al DNA stampo. Questo è l'unico stadio in cui la temperatura (*T*) può essere modificata in modo da ottenere la massima efficienza di appaiamento tra i *primer* e il DNA stampo.

3. Estensione: Si esegue a 72°C e si ha la sintesi di DNA a partire dall'estremità 3'.

Applicazioni Diagnostiche della PCR

Prima di iniziare il procedimento è importante conoscere la parte del DNA che si vuole amplificare. La PCR riesce a identificare velocemente e con estrema sensibilità la presenza di patogeni. Permette di diagnosticare la presenza di agenti infettivi come:

• Rosolia
• Toxoplasmosi
• Citomegalovirus
• Parvovirus B-19
• Papilloma virus
• HIV
• HCV
• Herpes virus
• Epstein Barr virus

Real Time PCR (PCR Quantitativa)

La *Real Time PCR* è una PCR in tempo reale, detta anche PCR quantitativa. Si tratta di un metodo di amplificazione e quantificazione simultanee del DNA. È una tecnica migliore rispetto alla PCR tradizionale "end point" poiché misura l'amplificazione durante la fase esponenziale della PCR, quando l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati.

Tecnologia del DNA Ricombinante e Applicazioni in Chimica Clinica

Descrivi cosa si intende per tecnologia del DNA ricombinante e le possibili applicazioni in chimica clinica.

Per tecnologia del DNA ricombinante si intende una serie di tecniche che permettono di inserire un segmento di DNA eterologo in un DNA accettore, ottenendo così un DNA ricombinante.

Le proteine ricombinanti sono tutte quelle proteine ottenute dalla trascrizione e traduzione di un frammento di DNA, codificante la proteina di interesse, clonato in vettori di espressione e in seguito inserito in un organismo ospite.

Organismi Ospite e Produzione

Gli organismi ospite possono essere:

• Procarioti: batteri (es. *E. Coli*);
• Eucarioti: lieviti, cellule di insetto o di mammifero in coltura.

Le proteine ricombinanti sono quindi caratterizzate a livello molecolare e immunochimico, altamente purificate, e permettono diagnosi e cure più precise.

Esempi di Applicazioni

Ad esempio, producendo proteine ricombinanti si possono ottenere:

• Vaccini: (es. antigene di superficie dell'epatite B, proteina della malaria);
• Agenti terapeutici: (es. insulina, fattori di crescita, fattori di coagulazione) per l'uomo;
• Risultati diagnostici (kit e reagenti).