Metabolismo Cellulare: Glicolisi, Ciclo di Krebs e Catena Respiratoria

Ingestione, digestione ed egestione cellulare

Molte sostanze nutrienti entrano nelle cellule, venendo ridotte (se applicabile) a monomeri e, talvolta, eliminate come scarti. Per analogia con i processi digestivi di un organismo pluricellulare, si può parlare di ingestione, digestione ed egestione cellulare.

• Ingestione: ioni e piccole molecole possono attraversare la membrana cellulare per diffusione o trasporto attivo, ma le particelle ad alta massa molecolare devono penetrare all'interno della cellula per endocitosi. Alcuni protozoi ingeriscono oggetti di grandi dimensioni, come i batteri, grazie ad una variante dell'endocitosi nota come fagocitosi. Nei vertebrati, solo alcune cellule specializzate, come i neutrofili e i macrofagi, realizzano questo processo per eliminare cellule morte o microrganismi infettivi, e mai per scopi prettamente nutrizionali.
• La digestione: in termini chimici, digerire significa idrolizzare, cioè rompere legami specifici mediante reazione con l'acqua. Nelle cellule eucariotiche questo processo avviene nei lisosomi, attraverso speciali proteine note come idrolasi acidi.
• Egestione: a seconda del tipo di cellula, il materiale che non può essere digerito dalle idrolasi può essere espulso per esocitosi o trattenuto a tempo indeterminato, nel qual caso le cellule si trovano in uno stato di accumulo intracellulare permanente.

Forme di produzione di energia

Gli organismi fototrofi catturano una piccola frazione dell'energia solare che raggiunge la Terra e la immagazzinano sotto forma di molecole complesse; il resto viene riflesso o riemesso sotto forma di radiazione infrarossa, disperdendosi nello spazio. L'importo di energia dispersa è superiore a quella concentrata, rispettando così la seconda legge della termodinamica. Esempi tipici sono le cellule del parenchima clorofilliano delle piante e le cellule delle alghe.

Da parte loro, gli organismi chemiotrofi estraggono l'energia immagazzinata nei legami chimici delle molecole nutrienti. Ancora una volta, essi dissipano una frazione significativa dell'energia ricevuta e ne deviano una piccola parte verso tutti i tipi di lavoro cellulare, tra cui la sintesi di macromolecole complesse. Le cellule dei chemiotrofi, tra cui si includono tutte le cellule animali e la maggior parte dei protozoi, ottengono energia libera dall'energia chimica di molecole associate che, seguendo un'analogia fisica, sono come molle parzialmente compresse. Le cellule chemiotrofe ingeriscono queste molecole e le degradano poco a poco in molecole più piccole, liberando così l'energia di queste "molle compresse".

Modi per ottenere elettroni

Il flusso di elettroni nelle reazioni redox è responsabile, direttamente o indirettamente, di tutto il lavoro svolto dalle cellule. Infatti, nelle vie cataboliche, i donatori di elettroni fungono spesso da fonti di energia. In natura ci sono molti donatori di elettroni e gli organismi, a seconda della loro natura chimica, possono essere classificati in:

• Chemiolitotrofia: riguarda gli organismi che estraggono elettroni da molecole inorganiche. Ad esempio, le piante ossidano l'acqua, producendo O₂ come sottoprodotto.
• Chemioorganotrofia: riguarda gli organismi che, come gli animali, ossidano i composti organici, da cui traggono elettroni oltre all'energia chimica.

Tenete a mente che ciò che realmente libera energia non è il donatore di elettroni in sé, ma la reazione chimica complessiva in cui esso si ossida. Se il donatore ha una minore affinità per gli elettroni rispetto all'accettore, questi fluiscono spontaneamente dal primo al secondo, liberando energia nel processo. Le cellule possiedono diversi meccanismi per sfruttare questa energia e compiere lavoro biologico.

Il Metabolismo

Il metabolismo è la somma di tutti i cambiamenti chimici che avvengono all'interno delle cellule. Si tratta di un'attività cellulare altamente coordinata, costituita da serie di reazioni chimiche chiamate vie metaboliche. Una via metabolica consiste in una sequenza che va da 2 a 20 reazioni consecutive, organizzate in modo tale che il prodotto della prima reazione diventi il reagente della seconda, e così via.

In ogni fase della via vi è un piccolo cambiamento chimico, di solito l'aggiunta, il trasferimento o la rimozione di un atomo o di un gruppo funzionale. Il risultato complessivo è la trasformazione di una molecola precursore in un prodotto finale attraverso una serie di intermedi metabolici chiamati metaboliti.

Alcune vie metaboliche sono lineari, altre sono ramificate (da un unico precursore si formano più prodotti) e altre ancora sono cicliche (un componente della via viene rigenerato durante la trasformazione dei precursori in prodotto).

L'equazione generale di una via metabolica si ottiene sommando membro a membro le equazioni chimiche che la compongono e semplificando i metaboliti che appaiono in quantità uguali su entrambi i lati dell'equazione. Ad esempio, in una via ciclica le equazioni potrebbero essere:

1. A + X₁ → B
2. B → C + Y
3. C + X₂ → D
4. D → 2A

L'equazione complessiva risultante è: X₁ + X₂ → Y + A

Classificazione delle vie metaboliche

È possibile classificare le vie metaboliche in due grandi categorie:

• Catabolismo: è la fase di degradazione del metabolismo. Le molecole complesse, come i polisaccaridi e le proteine, vengono trasformate in molecole semplici (etanolo, CO₂, NH₃...). Le vie cataboliche rilasciano energia, parte della quale viene recuperata principalmente sotto forma di nucleotidi come ATP, NADH e FADH2, mentre il resto viene dissipato sotto forma di calore. Queste vie tendono a essere convergenti, ovvero da precursori diversi si ottengono gli stessi prodotti finali.
• Anabolismo: è la fase di biosintesi. A partire da precursori semplici e nutrienti si ottengono molecole complesse (proteine, acidi nucleici...). Le vie anaboliche richiedono energia fornita da molecole di ATP, agenti riducenti come il NADPH o fonti di energia esterne come la luce. In generale, sono vie divergenti: a partire da pochi metaboliti specifici si formano molti prodotti finali differenti.

Gli Enzimi

Una caratteristica comune di tutte le reazioni metaboliche è che tendono ad avvenire molto lentamente, anche se sono energeticamente favorite, vale a dire anche se i prodotti di reazione (P) hanno un'energia libera minore rispetto ai reagenti o substrati (S).

Questo accade perché, affinché la reazione si completi in entrambi i sensi (S ↔ P), il sistema deve raggiungere uno stato di transizione ad alta energia, in cui i gruppi chimici sono allineati, le cariche elettriche vengono riorganizzate e i legami vengono modificati. Questo processo richiede un'elevata energia di attivazione.

La velocità di reazione può essere aumentata in due modi:

• Aumentando la temperatura: incrementando l'energia cinetica media delle molecole (energia termica). Questo metodo aumenta la frazione di molecole la cui energia supera la barriera di attivazione, ma è biologicamente impraticabile poiché le cellule sono sistemi sostanzialmente isotermi (funzionano a temperatura costante).
• Trovando vie di reazione alternative con un'energia di attivazione inferiore: questo metodo si basa sull'uso di molecole note come catalizzatori, che riducono l'altezza dello stato di transizione. I catalizzatori aumentano la velocità di reazione senza essere consumati nel processo e senza modificare l'equilibrio finale o l'energia libera della reazione: se una reazione non è spontanea senza catalizzatore, non lo sarà nemmeno in sua presenza.

La maggior parte dei catalizzatori biologici ha natura proteica e prende il nome di enzimi, sebbene siano state scoperte anche molecole di RNA catalitico chiamate ribozimi.

Alcuni enzimi hanno un nome classico che si forma in genere aggiungendo il suffisso -asi al nome del substrato (ad esempio, l'ureasi catalizza l'idrolisi dell'urea). Il nome sistematico, invece, identifica sia il substrato sia il tipo di reazione catalizzata. In base a questo, gli enzimi sono suddivisi in sei classi principali e relative sottoclassi, tutte numerate in modo specifico.

Proprietà degli enzimi

Per capire come gli enzimi riducano l'energia di attivazione, è necessario analizzare 4 caratteristiche fondamentali:

• Sito attivo: le reazioni metaboliche avvengono in cavità sulla superficie degli enzimi chiamate siti attivi. Ogni enzima ha uno o più siti attivi, che di solito coinvolgono non più di tre o quattro amminoacidi, a volte molto distanti nella struttura primaria dell'enzima. Il punto chiave nell'azione di un enzima è il legame del substrato (S) agli amminoacidi del sito attivo, formando il complesso enzima-substrato (ES). Successivamente, la reazione chimica porta alla formazione del complesso enzima-prodotto (EP). Infine, il prodotto P viene rilasciato, lasciando l'enzima pronto per un nuovo ciclo. Queste tappe sono reversibili; l'enzima accelera semplicemente il raggiungimento dell'equilibrio termodinamico del sistema.
• Saturazione con il substrato: l'esistenza del complesso ES è stata dedotta da esperimenti in cui sono state preparate diverse provette contenenti la stessa quantità di enzima libero, a cui sono state aggiunte quantità progressivamente crescenti del substrato S. Ci si aspetterebbe che la velocità iniziale di reazione di ciascuna provetta aumenti progressivamente, poiché l'equilibrio della reazione si sposta a destra all'aumentare della concentrazione di [S]. Tuttavia, quando [S] è molto elevata, tutte le molecole di enzima formano rapidamente il complesso ES, e un ulteriore aumento di [S] non ha alcun effetto sulla velocità iniziale. Si raggiunge così una velocità massima (V_max), e si dice che l'enzima è saturato con il suo substrato.
• Efficacia: le reazioni catalizzate da enzimi sono da 10⁵ a 10¹⁷ volte più veloci rispetto alle corrispondenti reazioni non catalizzate.
• Specificità: gli enzimi sono altamente specifici in due modi:
  • L'enzima agisce solo su un determinato substrato o su un gruppo ristretto di essi con caratteristiche comuni. Al contrario, i catalizzatori inorganici possono agire su molte sostanze diverse.
  • Avviene una sola reazione chimica specifica, senza generare reazioni collaterali o sottoprodotti (resa del 100%).

Cinetica enzimatica

Per una concentrazione fissa di enzima, la velocità iniziale V₀ di molte reazioni enzimatiche varia in modo iperbolico con la concentrazione del substrato [S]. All'aumentare di [S], aumenta anche V₀. Inizialmente l'aumento è quasi lineare, ma quando [S] è elevata, l'enzima si satura e V₀ smette di crescere, raggiungendo la velocità massima (V_max) della reazione.

Il rapporto tra V₀ e [S] può essere espresso dall'equazione matematica formulata nel 1913 dal biochimico tedesco Leonor Michaelis (1875-1949) e dalla dottoressa canadese Maud Menten (1879-1960):

In questa equazione, K_M è una costante caratteristica dell'enzima e del suo substrato, nota come costante di Michaelis. Per reazioni semplici, K_M può essere interpretata come una misura dell'affinità dell'enzima per il suo substrato: bassi valori di K_M indicano che il complesso ES è molto stabile e raramente si dissocia senza che il substrato abbia reagito per formare il prodotto. Come si può vedere dall'equazione, quando [S] = K_M, V₀ = 1/2 V_max.

Meccanismo d'azione enzimatica

L'elenco delle proprietà degli enzimi solleva diverse domande: perché l'efficacia e la specificità sono così straordinarie? Se il sito attivo è l'unico responsabile dell'attività enzimatica, perché è necessaria la restante parte della molecola? La risposta a queste domande si articola in due parti distinte ma complementari:

• Riorganizzazione dei legami covalenti: in molti enzimi si formano transitoriamente legami covalenti tra i residui amminoacidici del sito attivo e il substrato, che abbassano l'energia di attivazione e facilitano il raggiungimento dello stato di transizione. È anche comune il trasferimento di protoni o gruppi funzionali tra l'enzima e il substrato per stabilizzare un intermedio di reazione che altrimenti si decomporrebbe rapidamente.
• Interazioni non covalenti: l'efficacia di un enzima si basa sulla drastica diminuzione dell'energia di attivazione (ΔG^‡) della reazione catalizzata. Per ridurre questa barriera, il sistema deve acquisire un'energia equivalente. La maggior parte di questa energia deriva dalla cosiddetta energia di legame (ΔG_B), che viene rilasciata con la formazione di un gran numero di interazioni deboli, come legami a idrogeno o interazioni ioniche tra il substrato e l'enzima.

La necessità di molteplici interazioni non covalenti spiega perché un enzima sia molto più grande del suo solo sito attivo: l'enzima deve fornire gruppi funzionali posizionati correttamente grazie alla sua struttura terziaria per stabilire tali legami. Ciò spiega anche la sua specificità: solo i substrati che possiedono una struttura complementare possono interagire in modo ordinato con i gruppi funzionali dell'enzima.

In questo schema si riflettono le variazioni di energia di una reazione in assenza (blu) e in presenza (rosso) dell'enzima. L'energia di attivazione necessaria per raggiungere lo stato di transizione, rappresentata da ‡, è più bassa nel secondo caso (ΔG^‡_cat) rispetto al primo (ΔG^‡_{non cat}). La differenza tra le due è l'energia di legame (ΔG_B).

Fattori che influenzano l'attività enzimatica

L'attività enzimatica può essere influenzata da vari fattori fisici e chimici, come il pH o la temperatura.

Un cambiamento di pH può influenzare la carica elettrica delle catene laterali degli amminoacidi che devono interagire con il substrato; pertanto, ogni enzima ha un pH ottimale o un intervallo di pH in cui la sua attività è massima. Valori estremi di pH o di temperatura possono denaturare la proteina.

È inoltre possibile modificare l'attività dell'enzima mediante la presenza di inibitori, molecole che rallentano o bloccano le reazioni e che sono classificate in due categorie:

• Inibitori irreversibili: si legano all'enzima, di solito in modo covalente, modificando permanentemente un gruppo essenziale per l'attività catalitica e rendendolo inutilizzabile. Tra questi vi sono molti farmaci e veleni, come i gas nervini.
• Inibitori reversibili: formano legami non covalenti con l'enzima. Si dividono in:
  • Inibitori competitivi: assomigliano al substrato e si legano al sito attivo dell'enzima, ma non reagiscono. Riducono l'affinità dell'enzima per il suo substrato (aumentano la K_M), ma non influenzano la velocità massima della reazione: è sufficiente aumentare la concentrazione di substrato affinché l'enzima funzioni normalmente.
  • Inibitori acompetitivi: si legano solo al complesso ES e non all'enzima libero E. Il complesso enzima-substrato-inibitore (ESI) è cataliticamente inattivo, quindi la velocità massima diminuisce, così come la K_M.
  • Inibitori misti: si legano sia a E sia a ES, ma mai al sito attivo. Il legame dell'inibitore riduce sia l'affinità dell'enzima per il suo substrato (cioè aumenta la K_M) sia la velocità massima della reazione.

Cofattori e coenzimi

L'attività enzimatica può essere influenzata non solo da fattori fisici o chimici, ma anche dalla presenza di sostanze non proteiche, in genere a basso peso molecolare, chiamate cofattori.

Se i cofattori sono essenziali per l'attività enzimatica, l'enzima completo e attivo è chiamato oloenzima, mentre la sua parte proteica (cataliticamente inattiva da sola) è detta apoenzima.

Un cofattore può essere di natura inorganica o organica; alcuni enzimi richiedono entrambi.

• Cofattori inorganici: si tratta di ioni metallici come Fe²⁺, Cu⁺, Mg²⁺ o Zn²⁺, necessari solo in quantità giornaliere di milligrammi o microgrammi. Alcuni possono agire come elementi di coordinazione, unendo contemporaneamente il substrato e il sito attivo dell'enzima. Altri possono attrarre elettroni da un substrato (ad esempio, passando dallo ione Fe³⁺ a Fe²⁺) per poi trasferirli a un'altra molecola. Infine, alcuni ioni come il ferro o il rame possiedono di per sé una certa attività catalitica, che viene tuttavia fortemente amplificata dalla parte proteica.
• Cofattori organici o organometallici: sono noti come coenzimi se sono molecole debolmente associate all'apoenzima; se il legame è forte (covalente), vengono chiamati gruppi prostetici. In generale, queste molecole agiscono come trasportatori intermedi per gli enzimi che catalizzano reazioni di trasferimento di elettroni o di gruppi funzionali. Molti coenzimi sono vitamine idrosolubili modificate, ma esistono anche coenzimi non vitaminici come l'ATP o il coenzima Q (quest'ultimo non idrosolubile).

Regolazione dell'attività enzimatica

L'intera e complessa rete di reazioni metaboliche avviene all'interno di una cellula minuscola, e ogni reazione richiede un enzima specifico. Spesso, lo stesso metabolita fa parte di diverse vie metaboliche; se queste funzionassero tutte contemporaneamente, entrerebbero in competizione tra loro, rendendo il sistema inefficiente. Inoltre, la velocità di assorbimento dei nutrienti o di biosintesi delle macromolecole deve essere adattata in ogni momento alle esigenze della cellula. Infine, la differenziazione cellulare in un organismo pluricellulare richiede che ogni tipo di cellula esprima enzimi specifici.

Per tutte queste ragioni, l'attività enzimatica deve essere adeguatamente regolata. Questa regolazione avviene a due diversi livelli:

• Modifica dell'attività di enzimi chiave: la regolazione dell'azione metabolica si concentra in genere sugli enzimi che catalizzano le reazioni iniziali di una via metabolica. Esistono due meccanismi principali:
  • Transizioni allosteriche: la struttura tridimensionale dell'enzima subisce modifiche indotte dal legame di una molecola, detta effettore o modulatore, in un sito diverso dal sito attivo. A volte il modulatore stimola l'attività enzimatica (modulatore positivo o attivatore); più spesso, agisce come inibitore (modulatore negativo). Spesso il modulatore positivo è il substrato stesso, mentre quello negativo è il prodotto finale della via metabolica (feedback negativo).
  • Modulazione covalente: è tipica degli enzimi che possono esistere in due forme, attiva e inattiva, interconvertibili mediante legame covalente di un gruppo (ad esempio, gruppi fosforile). Questa unione è catalizzata da enzimi chiamati chinasi.
• Modifica della quantità di enzima: un secondo livello di regolazione consiste nel regolare la sintesi proteica a livello dei ribosomi o nel degradare gli enzimi in eccesso attraverso strutture chiamate lisosomi o proteasomi.

Respirazione e fermentazione

Tradizionalmente, i processi catabolici sono raggruppati in due grandi categorie, note come respirazione e fermentazione. Tuttavia, si tratta di una distinzione formale, poiché molte reazioni metaboliche sono comuni a entrambe. La respirazione è un processo chimico che avviene in tutte le cellule e consiste nella combustione di composti organici, preferibilmente il glucosio, che può essere rappresentata dalla seguente equazione complessiva:

Nell'equazione globale della respirazione del glucosio si possono considerare gli stati di ossidazione degli atomi di carbonio coinvolti, calcolati come il numero di legami diretti con l'ossigeno meno il numero di legami diretti con l'idrogeno:

Lo stato di ossidazione netto del glucosio, per quanto riguarda i suoi atomi di carbonio, è 0, mentre quello delle sei molecole di CO₂ è 6 × (+4) = +24. Ciò significa che gli atomi di carbonio si sono ossidati, cedendo un totale di 24 elettroni, che sono passati a formare altri legami con atomi dotati di maggiore "avidità" per questi elettroni.

L'affinità elettronica può essere quantificata tramite il potenziale redox, che non è altro che una tensione, una misura dell'energia potenziale in grado di spostare gli elettroni da alcuni legami ad altri. Gli elettroni, che sono particelle cariche negativamente, tendono a essere trasferiti verso un potenziale redox più positivo.

Una sostanza che può esistere in due forme, ossidata (ad esempio, NAD⁺) e ridotta (NADH), costituisce una coppia redox (la coppia NAD⁺/NADH in questo caso). La tendenza della forma ossidata ad acquisire elettroni e ridursi si misura tramite il suo potenziale di ossido-riduzione o potenziale redox, rappresentato da E ed espresso in millivolt (mV).

Se la respirazione fosse una semplice combustione, gli elettroni compirebbero un unico grande salto dal glucosio all'O₂, e questo salto sarebbe responsabile del rilascio improvviso di energia sotto forma di calore e luce. Non è questo il caso: nella respirazione, l'ossidazione del glucosio è suddivisa in piccoli passaggi controllati enzimaticamente, e gli elettroni scendono "gradino dopo gradino" attraverso coenzimi come il NAD⁺ e i citocromi, caratterizzati da piccole differenze di potenziale redox. In questo modo, l'energia viene rilasciata in quantità ideali per essere accoppiata alla sintesi di ATP.

Di conseguenza, la respirazione comporta la degradazione delle molecole organiche fino ad atomi di carbonio che raggiungono il massimo stato di ossidazione sotto forma di CO2, attraverso diversi passaggi che liberano energia in piccole quantità.

Il ruolo dell'O₂ è quello di fungere da accettore finale degli elettroni provenienti dai legami C-H dei nutrienti organici, inserendoli nei legami O-H dell'acqua. Questo processo si chiama respirazione aerobica.

Alcuni batteri utilizzano accettori finali alternativi, come lo ione SO₄^2- (ridotto a S o H₂S), lo ione Fe³⁺ (che si riduce a Fe²⁺), lo ione NO₃^- (ridotto a NO₂^- o anche a NH₃) o la CO₂ (che viene ridotta a CH₄). Il tipo di respirazione svolto da questi batteri è chiamato respirazione anaerobica.

Se l'accettore finale di elettroni non è una sostanza inorganica (come l'O₂ o gli accettori alternativi citati in precedenza), ma un'altra sostanza organica derivata dalla stessa molecola donatrice di elettroni, il processo anaerobico e catabolico viene chiamato fermentazione.

Tra le più importanti vi sono la fermentazione lattica e quella alcolica, che rispondono alle seguenti equazioni globali:

Le vie cataboliche principali sono essenzialmente tre: la glicolisi, la via dei pentoso fosfati e il ciclo di Krebs. Una delle scoperte più notevoli della prima metà del XX secolo fu che la fermentazione alcolica, la fermentazione lattica e la respirazione condividono le reazioni della prima di queste vie.

Glicolisi

La glicolisi è la via metabolica più universale, presente in quasi tutte le cellule, sia procariotiche sia eucariotiche. In onore dei suoi scopritori, è spesso nota come via di Embden-Meyerhof-Parnas o EMP.

Nella glicolisi, una molecola di glucosio viene scissa in due molecole a tre atomi di carbonio di piruvato (sotto forma ionizzata), attraverso una serie di dieci reazioni catalizzate da enzimi (da E1 a E10).

Attraverso la glicolisi, la cellula ottiene molecole ad alta energia come NADH e ATP dall'ossidazione del glucosio. Questa ossidazione riguarda un gruppo aldeidico (-CHO): nel corso delle reazioni catalizzate dagli enzimi centrali E6 ed E7 della sequenza, esso cede due elettroni sotto forma di ione idruro (H^-) e accetta un ossigeno, trasformandosi in un gruppo carbossilico (-COO^-). Il NAD⁺ è in grado quindi di raccogliere lo ione idruro (H^-) formando NADH, mentre l'energia rimanente viene utilizzata per convertire una molecola di ADP in ATP.

Affinché avvenga la reazione di ossidazione, la molecola di glucosio viene divisa in due triosi. Questo perché il glucosio ha un unico gruppo aldeidico sul carbonio 1; se si ossidasse solo quel carbonio, la molecola risultante manterrebbe quasi tutta l'energia del glucosio originale. La scissione dell'esoso fornisce invece due gruppi aldeidici ossidabili, raddoppiando la resa del processo.

Gli intermedi della glicolisi (tra il glucosio e il piruvato) legano covalentemente gruppi fosforile (-PO₃^2-), che conferiscono loro una carica negativa; in questo modo non possono attraversare la membrana plasmatica (priva di trasportatori per gli zuccheri fosforilati) né lasciare la cellula. Inoltre, l'associazione dei gruppi fosforile ai siti attivi degli enzimi fornisce un'energia di legame che contribuisce ad abbassare l'energia di attivazione, aumentando l'efficacia delle reazioni.

La scissione e la fosforilazione dell'esoso producono intermedi che forniscono 6 dei 13 precursori metabolici necessari per la sintesi delle macromolecole. Infatti, la glicolisi è una via anfibolica, coinvolta sia in processi catabolici sia anabolici, poiché la maggior parte delle sue reazioni è reversibile e può essere utilizzata per generare esosi a partire da molecole più piccole (gluconeogenesi).

Fasi della glicolisi

Nella glicolisi si possono distinguere due fasi principali:

1. Fase preparatoria (o di investimento energetico)

Durante questa fase l'esoso viene "preparato" per la reazione chiave della via, ossia l'ossidazione dei gruppi aldeidici dei due triosi fosfati, attraverso le seguenti tappe:

• Fosforilazione del glucosio: il glucosio entra nella cellula per diffusione facilitata (trasporto passivo) e il gruppo ossidrilico (-OH) sul carbonio 6 riceve un gruppo fosfato dall'ATP, diventando glucosio-6-fosfato (che non può più lasciare la cellula).
• Preparazione alla scissione dell'esoso: affinché la molecola di esoso si divida in due triosi fosforilati, deve essere fosforilata non solo sul carbonio 6, ma anche sul carbonio 1. Ciò richiede:
  • L'isomerizzazione del glucosio-6-fosfato in fruttosio-6-fosfato.
  • Una seconda fosforilazione, che consuma un'altra molecola di ATP e forma il fruttosio-1,6-bisfosfato.
• Formazione di due triosi fosforilati: si apre l'anello del fruttosio-1,6-bisfosfato e si rompe il legame tra i carboni 3 e 4. Si originano così la gliceraldeide-3-fosfato e il diidrossiacetone fosfato. Il gruppo carbonilico del chetone non si ossida facilmente come quello delle aldeidi (manca un legame C-H). Pertanto, il diidrossiacetone fosfato viene isomerizzato in una seconda molecola di gliceraldeide-3-fosfato.

2. Fase di recupero energetico (o dei benefici)

Paradossalmente, una via come la glicolisi, progettata per produrre ATP, inizia consumandone: la prima fase richiede due molecole di ATP, aumentando il contenuto di energia libera degli intermedi. Questo investimento iniziale viene recuperato nella seconda fase con gli "interessi"; questa serie di cinque reazioni (che avvengono due volte per ogni molecola di glucosio, poiché essa si divide in due molecole di gliceraldeide-3-fosfato) è nota come fase di recupero. Consiste in una sequenza di eventi:

• La gliceraldeide-3-fosfato viene ossidata mediante il trasferimento enzimatico di uno ione idruro (:H^-) dal gruppo aldeidico al NAD⁺. Il NAD⁺ si riduce a NADH, ma il gruppo aldeidico non viene ossidato direttamente a gruppo carbossilico, bensì a gruppo acil-fosfato nel 1,3-bisfosfoglicerato.
• Il gruppo acil-fosfato dell'1,3-bisfosfoglicerato viene trasferito all'ADP per formare ATP, convertendosi nel gruppo carbossilico del 3-fosfoglicerato.
• Il legame fosfoestere rimanente sul carbonio 3 del 3-fosfoglicerato ha un'energia di idrolisi relativamente bassa. Per poter trasferire questo gruppo fosfato all'ADP e recuperare l'ATP consumato nella fase preparatoria, è necessario spostare il legame dal carbonio 3 al carbonio 2, convertendo il 3-fosfoglicerato in 2-fosfoglicerato.
• Dopo questa riorganizzazione, il 2-fosfoglicerato viene disidratato diventando fosfoenolpiruvato, un composto fosforilato ad alta energia.
• Enfin, il gruppo fosfato viene trasferito dal fosfoenolpiruvato all'ADP, formando ATP e piruvato.

L'equazione globale della glicolisi si ottiene sommando le singole reazioni e semplificando i componenti comuni su entrambi i lati. Considerando che nella fase preparatoria vengono consumate due molecole di ATP, mentre nella fase di recupero (che avviene due volte) se ne producono quattro, il risultato netto è:

La via della glicolisi descritta avviene nel citoplasma della maggior parte dei procarioti ed eucarioti. L'eccezione più rilevante riguarda le piante, in cui avviene anche nei cloroplasti. Sebbene gli enzimi che catalizzano le reazioni della via possano differire da una cellula all'altra, il risultato finale è lo stesso in tutti i casi.

Molti carboidrati diversi dal glucosio possono entrare nella glicolisi dopo essere stati trasformati in uno degli intermedi della via:

• I polisaccaridi di riserva intracellulari, come il glicogeno, vengono mobilitati all'interno della cellula stessa da enzimi che rimuovono i residui di glucosio uno a uno sotto forma di glucosio-1-fosfato, successivamente convertito in glucosio-6-fosfato.
• I carboidrati ingeriti con la dieta, come l'amido, il lattosio o il saccarosio, vengono idrolizzati dall'azione di enzimi digestivi chiamati idrolasi. I monosaccaridi risultanti (fruttosio, galattosio, ecc.) attraversano l'epitelio intestinale e, dopo essere stati trasportati alle cellule, vengono utilizzati nella glicolisi previa fosforilazione, diventando infine glucosio-6-fosfato e fruttosio-6-fosfato.

Vie metaboliche successive alla glicolisi

I prodotti della glicolisi (piruvato, NADH) e vari intermedi (come il glucosio-6-fosfato) possono seguire vie differenti:

1. Via dei pentoso fosfati (o del fosfogluconato)

Una parte del glucosio-6-fosfato prodotto nella glicolisi viene deviata da questa via e ossidata esclusivamente nel citoplasma con le seguenti funzioni:

• Utilizzare cinque dei sei atomi di carbonio del glucosio per sintetizzare un pentoso, il ribosio-5-fosfato, componente essenziale di nucleotidi e acidi nucleici.
• Produrre NADPH come fonte di elettroni necessari per la sintesi di acidi grassi, colesterolo e ormoni steroidei.
• Metabolizzare i pentosi derivanti dalla digestione degli acidi nucleici, convertendoli in intermedi glicolitici come la gliceraldeide-3-fosfato.

2. Destino del piruvato e del NADH in condizioni anaerobiche

L'ossidazione dei composti organici libera elettroni che riducono il NAD⁺ a NADH. Poiché le cellule hanno una quantità limitata di NAD⁺, il NADH deve essere riciclato per rigenerarlo. In presenza di O₂, quest'ultimo accetta gli elettroni riossidando il NADH a NAD⁺; in condizioni anaerobiche (assenza di ossigeno), le cellule utilizzano il piruvato stesso come accettore di elettroni (fermentazione), riducendolo a prodotti come il lattato (fermentazione lattica), l'etanolo (fermentazione alcolica), il propionato o l'acetone.

3. Destino del piruvato e del NADH in condizioni aerobiche

La maggior parte delle cellule eucariotiche e un gran numero di batteri sono aerobici. Per questi organismi, la glicolisi è solo la prima fase della degradazione completa del glucosio tramite la respirazione, un processo in cui il piruvato formato nella glicolisi, invece di essere ridotto a lattato o altri prodotti di fermentazione, viene completamente ossidato a CO₂. Gli elettroni liberati vengono raccolti da accettori come il NAD⁺. Il NAD⁺ consumato si rigenera mediante il trasferimento degli elettroni dal NADH lungo una sequenza di trasportatori, chiamata catena respiratoria, fino all'O₂. Questo processo produce grandi quantità di energia, conservata sotto forma di ATP.

L'ossidazione del piruvato avviene attraverso il ciclo di Krebs, che nelle cellule eucariotiche si svolge nella matrice mitocondriale. Inoltre, il carbonio entra in questo ciclo sotto forma di gruppo acetile legato al coenzima A tramite un legame tioestere; la molecola risultante è l'acetil-coenzima A (abbreviato in acetil-CoA). Pertanto, il piruvato formatosi nel citosol deve essere trasportato nei mitocondri. Esso può diffondere liberamente attraverso la membrana mitocondriale esterna tramite le porine, ma per attraversare la membrana interna richiede un trasporto attivo mediato dalla traslocasi del piruvato, che scambia il piruvato con ioni OH^-.

Successivamente, il piruvato viene convertito in acetil-CoA dal complesso della piruvato deidrogenasi (costituito da tre diversi enzimi e vari coenzimi), un processo chiamato decarbossilazione ossidativa, la cui equazione complessiva è:

La decarbossilazione ossidativa inizia con la rimozione del carbonio 1 del piruvato sotto forma di CO₂. Il carbonio 2 diventa un gruppo aldeidico "attivato" che, come nella glicolisi, si ossida cedendo elettroni al NAD⁺. L'energia liberata dall'ossidazione viene conservata nel legame tioestere dell'acetil-CoA.

Ciclo di Krebs

Il ciclo di Krebs è centrale nella rete metabolica della cellula. Non solo rappresenta la via per la degradazione aerobica di tutte le molecole che possono essere convertite in un gruppo acetile, ma è anche un'importante fonte di precursori metabolici per la sintesi di amminoacidi, basi azotate o colesterolo.

Il nome del ciclo si deve al suo principale scopritore, il biochimico tedesco-britannico Hans Adolf Krebs (1900-1981), che lo propose come ciclo dell'acido citrico, dal nome della prima molecola che si forma nella via. Si tratta di un acido che possiede tre gruppi carbossilici, motivo per cui la via è chiamata anche ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA). Il ciclo di Krebs è una sequenza di otto reazioni organizzate in modo tale che l'ossalacetato, substrato della prima reazione, sia anche il prodotto dell'ultima.

Ad ogni giro si verificano i seguenti processi:

• Entrano due atomi di carbonio sotto forma di acetil-CoA e due molecole di H₂O attraverso reazioni di condensazione e idratazione.
• Escono, in cambio, due atomi di carbonio completamente ossidati sotto forma di CO₂ e due protoni H⁺.
• Vengono cedute tre coppie di elettroni al NAD⁺, formando tre molecole di NADH (in alcuni casi viene prodotto NADPH).
• Una quarta coppia di elettroni, meno energetica delle precedenti, non può ridurre il NAD⁺ ma riduce l'ubichinone (coenzima Q) a QH₂. Questa reazione è catalizzata da un enzima che utilizza il FAD come cofattore ed è ancorato alla membrana mitocondriale interna negli eucarioti (o alla membrana plasmatica nei procarioti), mentre gli altri enzimi del ciclo sono solubili rispettivamente nella matrice mitocondriale o nel citosol.
• Un'ossidazione è accoppiata a un processo di fosforilazione che produce ATP (nelle cellule animali si forma spesso GTP, che può successivamente trasferire il suo gruppo fosfato all'ADP per generare ATP).

Il risultato complessivo del ciclo di Krebs è l'ossidazione del gruppo acetile a CO₂, con la produzione di equivalenti riducenti (NADH, QH₂) e di una molecola ad alta energia (ATP/GTP).

Gli intermedi del ciclo sono utilizzati come precursori in varie vie anaboliche. Ad esempio, il succinil-CoA è un intermedio nella sintesi dell'eme (presente nell'emoglobina) e della clorofilla. Pertanto, il ciclo di Krebs è una via anfibolica. Gli intermedi che vengono sottratti per i processi anabolici devono essere reintegrati, altrimenti il ciclo si arresterebbe. Questo compito è svolto dalle cosiddette reazioni anaplerotiche (letteralmente di "riempimento"), che convertono il piruvato o il fosfoenolpiruvato in ossalacetato o malato.

Catabolismo proteico e lipidico

L'acetil-CoA rappresenta un punto di convergenza in cui confluiscono altri processi catabolici, oltre alla degradazione dei carboidrati.

1. Catabolismo degli acidi grassi

L'ossidazione degli acidi grassi avviene principalmente nei perossisomi delle piante e nei mitocondri degli animali. Il processo prevede tre fasi:

• Attivazione: gli acidi grassi con 12 o meno atomi di carbonio entrano liberamente nei mitocondri e vengono lì attivati. L'attivazione di quelli con 14 o più atomi di carbonio avviene invece sul lato citosolico della membrana mitocondriale esterna. Per superare la stabilità dei legami C-C, il gruppo carbossilico viene attivato formando un legame tioestere con il coenzima A, generando un acil-CoA (non acetil-CoA). Questo processo consuma l'equivalente di due legami ad alta energia dell'ATP, producendo AMP e pirofosfato (PPi), la cui immediata idrolisi in due fosfati inorganici (Pi) rilascia una grande quantità di energia che spinge la reazione verso la formazione di acil-CoA.
• Trasporto: gli acidi grassi attivati sul lato citosolico della membrana mitocondriale esterna devono attraversare la membrana mitocondriale interna. A tal fine, l'acil-CoA si lega transitoriamente alla carnitina, formando acil-carnitina, che attraversa la membrana tramite un trasportatore specifico per poi essere riconvertita in acil-CoA nella matrice mitocondriale.
• β-ossidazione: si tratta di un ciclo ripetitivo di quattro fasi. Le prime tre riguardano l'ossidazione del carbonio β (il secondo carbonio dopo il gruppo carbossilico) dell'acil-CoA. La quarta fase, la scissione tra i carboni α e β, genera una molecola di acetil-CoA e un acil-CoA con due atomi di carbonio in meno.

2. Catabolismo dei trigliceridi (o grassi)

Gli acidi grassi utilizzati come combustibile dalle cellule animali possono derivare dai triacilgliceroli ingeriti con la dieta, da quelli immagazzinati nei tessuti di riserva (come il tessuto adiposo) o da quelli prodotti nel fegato a partire da un eccesso di carboidrati. I grassi rappresentano la principale riserva energetica dell'organismo, poiché i loro atomi di carbonio sono quasi completamente ridotti rispetto a quelli degli zuccheri o degli amminoacidi, per cui la loro ossidazione fornisce molto più ATP. Essendo insolubili in acqua, non sono idratati e possono essere accumulati in modo molto più compatto nei tessuti di riserva.

Per entrare nelle cellule, i trigliceridi devono essere idrolizzati da enzimi chiamati lipasi, producendo glicerolo e acidi grassi:

triacilglicerolo + 3 H₂O ↔ glicerolo + 3 acidi grassi

Gli acidi grassi vengono trasportati nelle cellule dove subiscono la β-ossidazione. Il glicerolo, invece, viene fosforilato a spese di un ATP e successivamente ossidato a diidrossiacetone fosfato (producendo NADH), che entra nella via della glicolisi.

3. Catabolismo delle proteine

Negli animali, gli amminoacidi possono contribuire alla produzione di energia. Le piante, al contrario, non usano quasi mai gli amminoacidi come fonte energetica. Negli esseri umani, l'ossidazione degli amminoacidi avviene in tre diverse situazioni:

• Durante il normale turnover delle proteine cellulari: la maggior parte delle proteine cellulari ha una vita limitata e viene degradata. Ciò consente il riciclaggio dei componenti per rinnovare le strutture cellulari e per eliminare proteine estranee, denaturate o mal ripiegate. Le proteine a breve vita vengono degradate nel citosol all'interno di complessi proteici chiamati proteasomi, mentre quelle a vita più lunga vengono digerite nei lisosomi.
• Dieta ad alto contenuto proteico: le proteine alimentari vengono degradate ad amminoacidi nel tratto intestinale da enzimi chiamati proteasi. Se gli amminoacidi ingeriti superano il fabbisogno dell'organismo per la sintesi proteica, l'eccesso viene catabolizzato, poiché gli amminoacidi non possono essere accumulati come riserva.
• Durante il digiuno prolungato o in corso di malattie come il diabete mellito: in queste situazioni, le riserve di carboidrati sono esaurite o non possono essere utilizzate correttamente, per cui le proteine corporee vengono utilizzate come combustibile cellulare.

Il primo passo nella degradazione degli amminoacidi è la separazione del gruppo amminico dallo scheletro carbonioso. In generale, il gruppo amminico viene trasferito all'α-chetoglutarato da enzimi chiamati transaminasi, formando glutammato. Quest'ultimo raggiunge i mitocondri del fegato, dove il gruppo amminico viene rilasciato sotto forma di ione ammonio (NH₄⁺), che è tossico; nel fegato di molti animali esso viene convertito in urea (H₂N-CO-NH₂) attraverso il ciclo dell'urea. L'urea entra nel flusso sanguigno, raggiunge i reni e viene escreta con le urine.

Lo scheletro carbonioso risultante viene ossidato a intermedi del ciclo di Krebs, in particolare acetil-CoA, α-chetoglutarato, succinil-CoA, fumarato e ossalacetato. Alcuni amminoacidi vengono invece degradati a piruvato.

Catena respiratoria, trasporto degli elettroni e fosforilazione ossidativa

L'ATP si forma mediante l'aggiunta di un gruppo fosforile all'ADP (fosforilazione). Questo processo è accoppiato al trasferimento di una coppia di elettroni tra due sostanze separate da una differenza di potenziale redox di almeno 300 mV.

Nella fosforilazione a livello del substrato, il donatore di elettroni è un metabolita (come la gliceraldeide-3-fosfato) che si trasforma in un composto fosforilato ad alta energia, il quale trasferisce direttamente un gruppo fosforile all'ADP. La quantità di ATP ottenuta con questo metodo è ridotta.

La maggior parte dell'ATP nella respirazione cellulare deriva dalla riduzione dell'O₂ mediante elettroni donati dal NADH o da altri coenzimi (FADH₂, chinoni...) attraverso un sistema di trasportatori di membrana chiamato catena respiratoria. Questo processo, chiamato fosforilazione ossidativa, dipende dal flusso di H⁺ o Na⁺ attraverso le membrane.

La catena respiratoria è localizzata nella membrana plasmatica dei batteri o nella membrana mitocondriale interna delle cellule eucariotiche. Si compone di trasportatori di elettroni che agiscono in sequenza, la maggior parte dei quali sono proteine integrali di membrana dotate di gruppi prostetici in grado di accettare e cedere uno o due elettroni. Si riconoscono quattro classi di trasportatori: flavoproteine (FAD/FMN), coenzima Q o ubichinone (l'unico trasportatore lipidico che non fa parte di una proteina e si muove liberamente nel doppio strato fosfolipidico), citocromi (a, a₃, b, c, c₁) e proteine ferro-zolfo (centri Fe-S).

Fatta eccezione per l'ubichinone (che si muove nel doppio strato lipidico) e il citocromo c (che si trova nello spazio intermembrana), i trasportatori di elettroni della catena respiratoria formano complessi supramolecolari nella membrana mitocondriale interna. Nei mitocondri delle cellule animali si trovano quattro complessi principali:

• Complesso I (o NADH deidrogenasi): è più grande di un ribosoma e trasferisce gli elettroni dal NADH all'ubichinone. Contiene FMN come gruppo prostetico e almeno sei centri Fe-S.
• Complesso II (o succinato deidrogenasi): è l'enzima che catalizza il passaggio da succinato a fumarato nel ciclo di Krebs e cede elettroni all'ubichinone. Contiene FAD e tre centri Fe-S come gruppi prostetici.
• Complesso III (o complesso del citocromo bc₁): contiene i citocromi b e c₁, e un centro ferro-zolfo speciale chiamato centro di Rieske. Trasferisce gli elettroni dall'ubichinone al citocromo c.
• Complesso IV (o citocromo ossidasi): contiene i citocromi a e a₃ e atomi di rame capaci di passare dallo stato ossidato (Cu²⁺) a quello ridotto (Cu⁺). Trasferisce gli elettroni dal citocromo c all'O₂.

Nelle cellule vegetali è presente una deidrogenasi orientata verso il citosol che trasferisce gli elettroni dal NADH prodotto nella glicolisi direttamente all'ubichinone. Questo enzima è assente nelle cellule animali.

Questa assenza crea un problema nelle cellule animali: il complesso I raccoglie gli elettroni dal NADH solo se questo si trova nella matrice mitocondriale. Pertanto, il NADH generato nella glicolisi non potrebbe, in linea di principio, essere riossidato dalla catena respiratoria poiché si trova nel citoplasma e la membrana mitocondriale interna è impermeabile al NADH. Tuttavia, esistono sistemi navetta (shuttle) che trasportano gli elettroni dal NADH citosolico alla catena respiratoria attraverso una via indiretta. Il più attivo di questi, chiamato navetta malato-aspartato, trasferisce gli elettroni dal NADH citosolico a una molecola di NAD⁺ nella matrice, che si riduce a NADH e trasferisce poi i suoi elettroni al complesso I. La navetta del glicerolo-3-fosfato, caratteristica del muscolo scheletrico e del cervello, trasferisce invece gli elettroni direttamente all'ubichinone, bypassando il complesso I.

Il flusso di elettroni avviene da un trasportatore a un altro con un potenziale redox più positivo, e questo processo rilascia energia che può essere accoppiata alla sintesi di ATP. Questo accoppiamento avviene attraverso il meccanismo proposto nel 1961 dal biochimico britannico Peter Mitchell, noto come ipotesi chemiosmotica, un processo che si svolge in due fasi:

• Formazione di un gradiente protonico: i complessi I, III e IV della catena respiratoria agiscono come pompe protoniche, utilizzando l'energia fornita dal flusso di elettroni per espellere dalla matrice mitocondriale rispettivamente 4, 4 e 2 protoni (H⁺). In totale, vengono pompati 10 H⁺ per ogni NADH che dona elettroni alla catena respiratoria, e 6 H⁺ se gli elettroni entrano tramite l'ubichinone (FADH₂). Il risultato è la formazione di un gradiente di concentrazione protonica (e di carica) tra i due lati della membrana mitocondriale interna.
• Utilizzo del gradiente protonico per produrre ATP: poiché i protoni (H⁺) trasportano una carica elettrica, il loro accumulo su un lato della membrana genera sia una differenza di potenziale elettrico sia una differenza di pH, che insieme costituiscono la forza motrice protonica (un accumulo di energia potenziale). Questa energia viene rilasciata quando gli H⁺ rifluiscono passivamente verso la matrice. Questo rientro avviene attraverso un complesso proteico della membrana interna chiamato ATP sintasi (o ATPasi).

Confrontando il numero di H⁺ pompati dalla catena respiratoria con il numero di H⁺ necessari per produrre ATP, si può stimare la resa energetica. Tuttavia, va notato che il gradiente di H⁺ non è utilizzato esclusivamente per produrre ATP. Numerosi trasportatori che operano nella membrana mitocondriale interna ottengono la loro energia direttamente dal gradiente protonico, e non dall'ATP. Questo è il caso dei trasportatori che introducono nella matrice mitocondriale le molecole di Pi e ADP necessarie per la sintesi di ATP, esportando contemporaneamente l'ATP appena sintetizzato. Questi processi consumano ulteriori H⁺, influenzando il rapporto stechiometrico finale.

Ogni giorno si scoprono nuovi processi cellulari la cui fonte di energia non è l'idrolisi dell'ATP, bensì il flusso di ioni H⁺ secondo gradiente di concentrazione o, in molti casi, il flusso di ioni Na⁺. Possiamo quindi estendere l'analogia di Lipmann e concludere che tutte le cellule conosciute utilizzano due "valute energetiche": una solubile (l'ATP o, talvolta, il GTP) e un gradiente protonico (o di ioni sodio) associato alla membrana. L'ATP sintasi agisce come una sorta di "ufficio di cambio", in grado di convertire una valuta nell'altra.