Metodi di Identificazione Biochimica dei Microrganismi: Test OF e Serie IMViC

Ossidazione-fermentazione (OF) dei carboidrati

Esistono due processi con i quali si possono metabolizzare i carboidrati: fermentazione e ossidazione. La fermentazione avviene in condizioni di anaerobiosi, mentre l'ossidazione si realizza in presenza di ossigeno (entrambi sono processi redox). Gli anaerobi facoltativi, invece, sono tutti quei microrganismi che sono in grado di vivere sia in condizioni di anaerobiosi che di aerobiosi. Di conseguenza, sapere se uno zucchero viene fermentato, ossidato o non metabolizzato ci permette la differenziazione di alcuni microrganismi.

Base del metodo

Per questa prova si utilizzerà un terreno OF agar addizionato allo zucchero scelto e un indicatore (blu di bromotimolo) che andrà a dare una colorazione gialla al terreno in caso di acidificazione.

La giara per anaerobiosi

È uno strumento utilizzato per incubare colture di microrganismi anaerobici. È costituito da un contenitore a chiusura ermetica all'interno della quale viene posta una busta che, se bagnata, riesce a creare un'atmosfera priva di ossigeno.

Risultati

• Microrganismi ossidanti: producono una reazione acida (colore giallo) solo nella provetta esposta all'aria.
• Microrganismi fermentanti: producono una reazione acida (colorazione gialla in entrambe le provette).
• Microrganismi non fermentanti e non ossidanti: danno una reazione alcalina nel terreno scoperto e non modificano il pH in quello contenente paraffina.

Colture: A. faecalis, E. coli, Ps. aeruginosa.
Terreni: lattosio, saccarosio, paraffina, glucosio e OF agar.

Procedimento

1. Preparare e sterilizzare i terreni.
2. Preparare per ogni microrganismo 2 provette con 5 mL di ciascun terreno. Ossia, usando i 3 zuccheri indicati, ogni batterio avrà a disposizione 6 terreni: 2 con Lattosio, 2 con Glucosio e 2 con Saccarosio.
3. Siglare ciascuna coppia di provette con (A) e (B).
4. Seminare ciascun microrganismo con tecnica sterile e per infissione nelle 6 provette corrispondenti.
5. Coprire il terreno di ciascuna provetta (A) con circa 2 mL di paraffina liquida.
6. Incubare a 32-35°C per 48 h.
7. Osservare se nelle varie provette è virato il colore.

Reazioni biochimiche caratteristiche: IMViC

Con questa sigla si sta ad indicare una serie di reazioni biochimiche che, completate da altri test, servono a caratterizzare alcuni microrganismi appartenenti agli ENTEROBATTERI, la cui presenza nel campione determina o meno la contaminazione fecale.

Significato di IMViC

• I: Indolo
• M: Rosso Metile
• Vi: Voges-Proskauer
• C: Citrato

Tabella riassuntiva dei risultati

• E. coli: positivo a indolo e rosso metile; negativo al resto.
• E. aerogenes: positivo a Voges-Proskauer e citrato; negativo al resto.

1° Test: Test dell'indolo

Serve ad identificare i microrganismi capaci di degradare l'amminoacido triptofano (indolalanina) per l'intervento di enzimi chiamati triptofanasi. Questo test aiuta a distinguere l'E. coli. Dalla demolizione del triptofano si ottiene indolo; la degradazione ad indolo, sempre accompagnata dalla formazione di ammoniaca e di acido piruvico, è svelabile con il reattivo di Kovacs, che dà luogo ad un composto di colore rosso.

Terreni e reattivi: acqua triptonata e reattivo di Kovacs.
Colture: E. coli, E. aerogenes, P. vulgaris e Ps. aeruginosa.

Procedimento

1. Allestire con 5 mL del terreno preparato tante provette quanti sono i microrganismi in esame e sterilizzare in autoclave per 15' a 121°C.
2. Incubare a 32-35°C per 24-48 h.
3. Aggiungere a ciascuna provetta una decina di gocce di reattivo di Kovacs e agitare delicatamente.
4. Lasciare riposare per qualche minuto: la formazione di un anello rosso sulla superficie del terreno costituisce una prova positiva.

2° Test: Test del Rosso Metile (MR)

Il glucosio è uno dei substrati preferiti per gli Enterobatteri e i prodotti metabolici finali ottenuti dalla sua demolizione attraverso la fermentazione dipendono dal loro corredo enzimatico. Controllando il pH del terreno dopo il periodo di incubazione, si può evidenziare che quello che presenta colture di E. aerogenes è meno acido di quello di E. coli. Aggiungendo qualche goccia di rosso metile si potranno distinguere gli organismi che producono e conservano un'elevata acidità da quelli che non la conservano.

Terreni e reattivi: Brodo MR-VP e Rosso Metile.
Colture: E. coli e E. aerogenes.

Procedimento

1. Allestire 6 provette contenenti 5 mL di terreno.
2. Siglare le 6 provette (2 con MR e 4 con VP) e seminare con tecnica sterile ciascun batterio in esame in 3 provette: 1 MR e 2 VP.
3. Incubare a 30°C per 3-5 giorni oppure a 35°C per 48 h.
4. Aggiungere a ciascun tubo siglato MR 5 gocce del reattivo rosso di metile.
5. Osservare la colorazione: rossa se positiva, gialla se negativa.

3° Test: Test di Voges-Proskauer (VP)

Permette di verificare la capacità di alcuni microrganismi di produrre acetilmetilcarbinolo (acetoina) durante la fermentazione del glucosio. Questo metabolita viene messo in evidenza con la reazione di Barritt o con la reazione di O'Meara. È fondamentale che il pH del terreno sia basico e che la reazione avvenga in presenza di ossigeno.

Terreni e reattivi: Brodo MR-VP, Reattivo di Barritt (α-naftolo e KOH) o reattivo di O'Meara, creatina.
Colture: E. coli, E. aerogenes, S. aureus e M. luteus.

Procedimento

Utilizzare le provette di terreno MR-VP preparate precedentemente e siglate VP:

• Prova A (Barritt): Prendere una provetta con E. coli e una con E. aerogenes; aggiungere ad entrambe 0,5 mL di soluzione etanolica di α-naftolo al 5% e 0,2 mL di KOH al 40%. Agitare energicamente e lasciare a riposo per 10-15' le provette stappate a temperatura ambiente. La reazione è positiva se compare una colorazione rosa/rossa sulla superficie.
• Prova B (O'Meara): Nelle altre 2 provette aggiungere un pizzico di creatina in polvere (circa 25 mg) e 5 mL di KOH al 40%. Agitare e lasciare a riposo le provette stappate (1-2 h). La reazione è positiva se compare una colorazione rosata.

4° Test: Test del citrato

Questo test serve per individuare i batteri che, in assenza di altre fonti di carbonio, sono capaci di utilizzare il citrato di sodio come fonte di energia. Questi organismi, tramite la "citrato permeasi", trasportano il composto nella cellula dove viene demolito dall'enzima citrasi. Il cambiamento del pH viene rilevato dal blu di bromotimolo che vira al blu.

Terreni e reagenti: Simmons Citrate Agar.
Colture: Ps. aeruginosa, E. coli, E. aerogenes.

Procedimento

1. Allestire con 5 mL di terreno tante provette quanti sono i microrganismi.
2. Sterilizzare in autoclave per 15' a 121°C.
3. Inclinare i tubi per preparare gli "slant" (becchi di clarino) e siglare.
4. Seminare per strisciamento e infissione. Nota: Non prelevare terreno di coltura insieme al materiale batterico; l'isolamento deve essere fatto su terreno solido.
5. Incubare a 32-35°C per 48 h o più.
6. La prova è positiva se la superficie dello slant si colora di blu.

Ricerca della gelatinasi

Il terreno utilizzato è costituito da brodo nutriente supplementato con il 12% di gelatina. Le colture che appaiono liquefatte dopo il raffreddamento contengono batteri che producono l'enzima gelatinasi.

Terreni e reattivi: Gelatina nutriente e mercurio cloruro.
Colture: E. coli, P. vulgaris, B. cereus, S. aureus.

Procedimento

1. Allestire provette con 10 mL di terreno e sterilizzare a 121°C per 15'.
2. Far solidificare in frigorifero, siglare e seminare per infissione.
3. Incubare a 32-35°C per 24-48 h (o a temperatura ambiente per più giorni).
4. Mettere le colture in frigorifero o in bagno di ghiaccio per 30'.
5. Esaminare la liquefazione: se il terreno resta liquido, il test è positivo (+).

Motilità dei batteri

Le strutture che permettono il movimento dei batteri sono i flagelli. Il test si esegue in un terreno semisolido per osservare la migrazione cellulare dal punto di inoculo.

Procedimento

1. Preparare il terreno e allestire coppie di provette (10 mL ciascuna) per ogni microrganismo.
2. Sterilizzare in autoclave per 15' a 121°C.
3. Lasciare solidificare e siglare le coppie (A) e (B).
4. Seminare per infissione verticale al centro di ogni provetta.
5. Incubare le provette (A) a 32-35°C per 24-48 h e le provette (B) a 15-25°C (temperatura ambiente) per qualche giorno.
6. Risultato: Il test è positivo se il canale di infissione presenta ramificazioni o se la crescita invade tutto il terreno. È negativo se la crescita avviene solo lungo il canale di infissione.

Test dell'ureasi

L'ureasi è un enzima capace di decomporre l'urea in ammoniaca e CO2. L'uso di un terreno liquido tamponato permette di distinguere il genere Proteus da altri microrganismi.

Procedimento

1. Preparare il terreno e distribuire in provette sterili (10 mL ciascuna).
2. Inoculare le provette con le colture in esame.
3. Incubare a 32-35°C per 5-6 h (preferibilmente a bagnomaria).
4. Risultato: La reazione positiva è indicata dal viraggio del colore dal giallo (pH 6,8) al rosso ciliegia (pH 8 o superiore).
5. Riportare i risultati in tabella.