Tecniche di Ibridazione, Clonazione e Amplificazione del DNA
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Ibridazione con sonde a DNA: ricerca specifica di un gene
L'ibridazione del DNA è un fenomeno naturale che rappresenta una delle tecniche fondamentali nella tecnologia del DNA ricombinante. Si tratta del processo in cui due filamenti di DNA a catena singola, con una sequenza di basi complementari, si uniscono per formare una molecola di DNA a doppia elica correttamente accoppiata.
Perché l'ibridazione è fondamentale?
Questa tecnica permette di identificare la presenza di un gene che codifica una proteina di interesse su un cromosoma. Per farlo, si utilizza un test di ibridazione con sonde di DNA.
- Sonda a DNA: un frammento di DNA artificiale a singolo filamento, marcato con sostanze radioattive o fluorescenti, complementare alla sequenza nucleotidica del gene da rilevare.
- Rilevazione: una volta avvenuta l'ibridazione, la sonda viene rilevata tramite metodi come l'impressione su film radiografico.
Microarray e Biochip
Quando si desidera analizzare migliaia di geni contemporaneamente, si utilizzano i microarray o biochip. Questi dispositivi, simili ai chip di silicio, consistono in lastre di vetro su cui sono fissate, in cellule microscopiche, migliaia di sequenze di DNA a singolo filamento.
La tecnologia dei microarray è utilizzata per:
- Individuare geni responsabili di malattie (emofilia, fibrosi cistica, Huntington, distrofia di Duchenne).
- Controllare l'espressione genica in linee cellulari tumorali.
- Diagnosticare malattie infettive.
- Personalizzare i trattamenti farmacologici in base alle differenze genetiche individuali.
Clonazione del DNA
La clonazione consiste nel produrre copie geneticamente identiche. Quando applicata al DNA, la clonazione di un frammento permette di ottenere miliardi di copie identiche.
Il processo di clonazione
- Vettore di clonazione: Si utilizza una piccola molecola di DNA (spesso un plasmide batterico) capace di entrare in un batterio e auto-replicarsi.
- Taglio e ricombinazione: Il plasmide e il DNA da clonare vengono tagliati con lo stesso enzima di restrizione e uniti per formare plasmidi ricombinanti.
- Trasformazione: I plasmidi vengono inseriti in una coltura batterica (solitamente Escherichia coli).
- Selezione: Poiché i plasmidi portano geni di resistenza agli antibiotici, solo i batteri trasformati sopravvivono in terreni di coltura contenenti l'antibiotico.
L'insieme dei cloni ottenuti da una raccolta di DNA di interesse è chiamato libreria genomica.
Amplificazione del DNA: La PCR
La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che permette di copiare o amplificare milioni di volte un segmento specifico di DNA in vitro, senza ricorrere alla clonazione cellulare.
Componenti della PCR
- DNA stampo: Il materiale di partenza.
- Nucleotidi: I mattoni per la sintesi.
- Primer: Brevi sequenze a singolo filamento complementari ai fianchi del gene da copiare.
- Taq polimerasi: Un enzima resistente al calore (isolato dal batterio Thermus aquaticus) che sintetizza le nuove catene di DNA.
La PCR è uno strumento di routine utilizzato per analizzare campioni biologici in ambito forense (scena del crimine), identificare microrganismi patogeni o effettuare diagnosi prenatali di malattie genetiche.